Faktor gangguan dalam tindak balas PCR

Semasa tindak balas PCR, beberapa faktor yang mengganggu sering ditemui.
Oleh kerana kepekaan PCR yang sangat tinggi, pencemaran dianggap sebagai salah satu faktor yang paling penting yang mempengaruhi keputusan PCR dan boleh menghasilkan hasil positif palsu.
Sama kritikal adalah pelbagai sumber yang membawa kepada hasil negatif palsu. Jika satu atau lebih bahagian penting campuran PCR atau tindak balas penguatan itu sendiri dihalang atau diganggu, ujian diagnostik boleh dihalang. Ini boleh menyebabkan kecekapan yang dikurangkan dan juga hasil negatif palsu.
Sebagai tambahan kepada perencatan, kehilangan integriti asid nukleik sasaran mungkin berlaku disebabkan oleh keadaan penghantaran dan/atau penyimpanan sebelum penyediaan sampel. Khususnya, suhu tinggi atau penyimpanan yang tidak mencukupi boleh menyebabkan kerosakan sel dan asid nukleik. Penetapan sel dan tisu dan embedding parafin adalah penyebab pemecahan DNA dan masalah yang berterusan (lihat Rajah 1 dan 2). Dalam kes ini, walaupun pengasingan dan pemurnian yang optimum tidak akan membantu.

Rajah 1 | Kesan immobilisasi pada integriti DNA
Elektroforesis gel agarose menunjukkan bahawa kualiti DNA yang diasingkan dari bahagian parafin autopsi berbeza -beza. DNA panjang serpihan purata yang berbeza hadir dalam ekstrak bergantung kepada kaedah penetapan. DNA dipelihara hanya apabila ditetapkan dalam sampel beku asli dan dalam formalin neutral buffered. Penggunaan formalin yang mengandungi formalin yang mengandungi asid, yang tidak dapat dibatalkan, mengakibatkan kehilangan DNA yang ketara. Baki pecahan sangat berpecah -belah.
Di sebelah kiri, panjang serpihan dinyatakan dalam pasangan kilobase (KBP)

Rajah 2 | Kehilangan integriti sasaran asid nukleat
(a) Jurang 3'-5 'pada kedua-dua helai akan mengakibatkan rehat dalam DNA sasaran. Sintesis DNA masih akan berlaku pada serpihan kecil. Walau bagaimanapun, jika tapak penyepala primer hilang pada serpihan DNA, hanya amplifikasi linear berlaku. Dalam kes yang paling baik, serpihan boleh resaturasi satu sama lain, tetapi hasilnya akan kecil dan di bawah paras pengesanan.
(b) Kehilangan pangkalan, terutamanya disebabkan oleh pembentukan dimer dan thymidine dimer, membawa kepada penurunan bilangan ikatan H dan penurunan TM. Semasa fasa pemanasan yang memanjang, primer akan mencairkan dari DNA matriks dan tidak akan menyebarkan walaupun di bawah keadaan yang kurang ketat.
(c) Pangkalan timin bersebelahan membentuk dimer TT.
Satu lagi masalah biasa yang sering berlaku dalam diagnostik molekul adalah pelepasan asid nukleik sasaran yang kurang optimum berbanding dengan pengekstrakan fenol-kloroform. Dalam kes yang melampau, ini boleh dikaitkan dengan negatif palsu. Banyak masa boleh disimpan oleh lisis mendidih atau pencernaan enzimatik serpihan sel, tetapi kaedah ini sering menyebabkan kepekaan PCR yang rendah disebabkan oleh pelepasan asid nukleik yang tidak mencukupi.

Perencatan aktiviti polimerase semasa penguatan

Secara umum, perencatan digunakan sebagai konsep kontena untuk menggambarkan semua faktor yang membawa kepada hasil PCR suboptimal. Dalam pengertian biokimia yang ketat, perencatan adalah terhad kepada aktiviti enzim, iaitu, ia mengurangkan atau menghalang penukaran produk substrat melalui interaksi dengan tapak aktif polimerase DNA atau cofactornya (misalnya, Mg2+ untuk polimer DNA Taq).
Komponen dalam sampel atau pelbagai buffer dan ekstrak yang mengandungi reagen boleh menghalang enzim atau memerangkap cofactorsnya (contohnya EDTA), dengan itu tidak mengaktifkan polimerase dan seterusnya menyebabkan penurunan atau hasil PCR negatif palsu.
Walau bagaimanapun, banyak interaksi antara komponen tindak balas dan asid nukleik yang mengandungi sasaran juga ditetapkan sebagai 'inhibitor PCR'. Sebaik sahaja integriti sel terganggu oleh pengasingan dan asid nukleik dilepaskan, interaksi antara sampel dan larutan sekitarnya dan fasa pepejal boleh berlaku. Sebagai contoh, 'Scavengers' boleh mengikat DNA tunggal atau berganda melalui interaksi bukan kovalen dan mengganggu pengasingan dan pembersihan dengan mengurangkan bilangan sasaran yang akhirnya mencapai kapal tindak balas PCR.
Secara umum, inhibitor PCR terdapat dalam kebanyakan cecair badan dan reagen yang digunakan untuk ujian diagnostik klinikal (urea dalam air kencing, hemoglobin dan heparin dalam darah), suplemen makanan (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) dan komponen dalam persekitaran (fenol, logam berat)

Lebih banyak inhibitor PCR yang lazim boleh didapati dalam sel-sel bakteria dan eukariotik, DNA bukan sasaran, makromolekul mengikat DNA matriks tisu dan peralatan makmal seperti sarung tangan dan plastik. Pembersihan asid nukleik semasa atau selepas pengekstrakan adalah kaedah pilihan untuk mengeluarkan perencat PCR.
Hari ini, pelbagai peralatan pengekstrakan automatik boleh menggantikan banyak protokol manual, tetapi pemulihan 100% dan/atau penyucian sasaran tidak pernah dicapai. Inhibitor yang berpotensi mungkin masih terdapat dalam asid nukleik yang disucikan atau mungkin telah berkuatkuasa. Strategi yang berbeza wujud untuk mengurangkan kesan perencat. Pilihan polimerase yang sesuai boleh memberi kesan yang signifikan terhadap aktiviti inhibitor. Kaedah terbukti lain untuk mengurangkan perencatan PCR meningkatkan kepekatan polimerase atau memohon bahan tambahan seperti BSA.
Perencatan tindak balas PCR boleh ditunjukkan dengan penggunaan Kawalan Kualiti Proses Dalaman (IPC).
Penjagaan mesti diambil untuk menghapuskan semua reagen dan penyelesaian lain dalam kit pengekstrakan, seperti etanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol dan fenol, dari asid nukleik yang diasingkan oleh langkah mencuci menyeluruh. Bergantung pada kepekatan mereka, mereka boleh mengaktifkan atau menghalang PCR.