Faktor gangguan dalam tindak balas PCR

Semasa tindak balas PCR, beberapa faktor yang mengganggu sering ditemui.
Disebabkan sensitiviti PCR yang sangat tinggi, pencemaran dianggap sebagai salah satu faktor terpenting yang mempengaruhi keputusan PCR dan boleh menghasilkan keputusan positif palsu.
Sama pentingnya ialah pelbagai sumber yang membawa kepada keputusan negatif palsu. Jika satu atau lebih bahagian penting campuran PCR atau tindak balas amplifikasi itu sendiri dihalang atau diganggu, ujian diagnostik boleh terhalang. Ini boleh menyebabkan kecekapan yang berkurangan dan juga keputusan negatif palsu.
Selain perencatan, kehilangan integriti asid nukleik sasaran mungkin berlaku disebabkan oleh keadaan penghantaran dan/atau penyimpanan sebelum penyediaan sampel. Khususnya, suhu tinggi atau penyimpanan yang tidak mencukupi boleh mengakibatkan kerosakan sel dan asid nukleik. Fiksasi sel dan tisu serta pembenaman parafin adalah punca pemecahan DNA yang diketahui umum dan masalah yang berterusan (lihat Rajah 1 dan 2). Dalam kes ini, pengasingan dan penulenan yang optimum pun tidak akan membantu.

Rajah 1 | Kesan imobilisasi terhadap integriti DNA
Elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahawa kualiti DNA yang diasingkan daripada bahagian parafin autopsi berbeza-beza dengan ketara. DNA dengan purata panjang serpihan yang berbeza terdapat dalam ekstrak bergantung pada kaedah fiksasi. DNA hanya dipelihara apabila difiksasi dalam sampel beku asli dan dalam formalin neutral yang ditimbal. Penggunaan fiksatif Bouin yang sangat berasid atau formalin yang mengandungi asid formik yang tidak ditimbal mengakibatkan kehilangan DNA yang ketara. Pecahan yang tinggal sangat berpecah-belah.
Di sebelah kiri, panjang serpihan dinyatakan dalam pasangan kilobase (kbp)

Rajah 2 | Kehilangan integriti sasaran asid nukleik
(a) Jurang 3′-5′ pada kedua-dua untaian akan mengakibatkan kerosakan pada DNA sasaran. Sintesis DNA masih akan berlaku pada serpihan kecil. Walau bagaimanapun, jika tapak penyepuhlindapan primer tiada pada serpihan DNA, hanya amplifikasi linear sahaja yang berlaku. Dalam kes yang paling baik, serpihan mungkin menepu semula antara satu sama lain, tetapi hasilnya akan menjadi kecil dan di bawah tahap pengesanan.
(b) Kehilangan bes, terutamanya disebabkan oleh penyahpurinatan dan pembentukan dimer timidin, menyebabkan penurunan bilangan ikatan-H dan penurunan Tm. Semasa fasa pemanasan yang memanjang, primer akan mencair daripada DNA matriks dan tidak akan hangus walaupun dalam keadaan yang kurang ketat.
(c) Bes timina bersebelahan membentuk dimer TT.
Satu lagi masalah biasa yang sering berlaku dalam diagnostik molekul ialah pembebasan asid nukleik sasaran yang kurang optimum berbanding pengekstrakan fenol-kloroform. Dalam kes yang teruk, ini boleh dikaitkan dengan hasil negatif palsu. Banyak masa boleh dijimatkan dengan lisis mendidih atau pencernaan enzimatik serpihan sel, tetapi kaedah ini selalunya menghasilkan kepekaan PCR yang rendah disebabkan oleh pembebasan asid nukleik yang tidak mencukupi.

Perencatan aktiviti polimerase semasa amplifikasi

Secara amnya, perencatan digunakan sebagai konsep kontena untuk menggambarkan semua faktor yang membawa kepada keputusan PCR suboptimum. Dalam erti kata biokimia yang ketat, perencatan terhad kepada aktiviti enzim, iaitu, ia mengurangkan atau menghalang penukaran substrat-produk melalui interaksi dengan tapak aktif DNA polimerase atau kofaktornya (contohnya, Mg2+ untuk Taq DNA polimerase).
Komponen dalam sampel atau pelbagai penimbal dan ekstrak yang mengandungi reagen boleh menghalang enzim secara langsung atau memerangkap kofaktornya (contohnya EDTA), sekali gus menyahaktifkan polimerase dan seterusnya membawa kepada keputusan PCR yang menurun atau negatif palsu.
Walau bagaimanapun, banyak interaksi antara komponen tindak balas dan asid nukleik yang mengandungi sasaran juga ditetapkan sebagai 'perencat PCR'. Sebaik sahaja integriti sel terganggu oleh pengasingan dan asid nukleik dibebaskan, interaksi antara sampel dan larutan di sekelilingnya serta fasa pepejal boleh berlaku. Contohnya, 'pembuang sisa' boleh mengikat DNA untai tunggal atau dua melalui interaksi bukan kovalen dan mengganggu pengasingan dan penulenan dengan mengurangkan bilangan sasaran yang akhirnya sampai ke saluran tindak balas PCR.
Secara amnya, perencat PCR terdapat dalam kebanyakan cecair badan dan reagen yang digunakan untuk ujian diagnostik klinikal (urea dalam air kencing, hemoglobin dan heparin dalam darah), suplemen diet (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) dan komponen dalam persekitaran (fenol, logam berat)

Perencat PCR yang lebih lazim boleh ditemui dalam bakteria dan sel eukariotik, DNA bukan sasaran, makromolekul pengikat DNA bagi matriks tisu dan peralatan makmal seperti sarung tangan dan plastik. Penulenan asid nukleik semasa atau selepas pengekstrakan adalah kaedah pilihan untuk membuang perencat PCR.
Hari ini, pelbagai peralatan pengekstrakan automatik boleh menggantikan banyak protokol manual, tetapi pemulihan dan/atau penulenan 100% sasaran tidak pernah dicapai. Perencat berpotensi mungkin masih terdapat dalam asid nukleik yang telah ditulenkan atau mungkin telah pun berkuat kuasa. Terdapat pelbagai strategi untuk mengurangkan kesan perencat. Pemilihan polimerase yang sesuai boleh memberi impak yang ketara terhadap aktiviti perencat. Kaedah lain yang terbukti untuk mengurangkan perencatan PCR adalah dengan meningkatkan kepekatan polimerase atau menggunakan bahan tambahan seperti BSA.
Perencatan tindak balas PCR boleh ditunjukkan melalui penggunaan kawalan kualiti proses dalaman (IPC).
Perlu berhati-hati untuk mengeluarkan semua reagen dan larutan lain dalam kit pengekstrakan, seperti etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol dan fenol, daripada isolat asid nukleik melalui langkah pencucian yang teliti. Bergantung pada kepekatannya, ia mungkin mengaktifkan atau menghalang PCR.