Faktor gangguan dalam tindak balas PCR

Semasa tindak balas PCR, beberapa faktor yang mengganggu sering ditemui.
Oleh kerana sensitiviti PCR yang sangat tinggi, pencemaran dianggap sebagai salah satu faktor terpenting yang mempengaruhi keputusan PCR dan boleh menghasilkan keputusan positif palsu.
Sama kritikal ialah pelbagai sumber yang membawa kepada keputusan negatif palsu. Jika satu atau lebih bahagian penting campuran PCR atau tindak balas amplifikasi itu sendiri dihalang atau diganggu, ujian diagnostik boleh dihalang. Ini boleh menyebabkan kecekapan berkurangan dan juga keputusan negatif palsu.
Selain perencatan, kehilangan integriti asid nukleik sasaran mungkin berlaku disebabkan oleh penghantaran dan/atau keadaan penyimpanan sebelum penyediaan sampel. Khususnya, suhu tinggi atau penyimpanan yang tidak mencukupi boleh menyebabkan kerosakan sel dan asid nukleik. Penetapan sel dan tisu serta pembenaman parafin adalah punca pemecahan DNA yang terkenal dan masalah yang berterusan (lihat Rajah 1 dan 2). Dalam kes ini, pengasingan dan pembersihan optimum tidak akan membantu.

Rajah 1 | Kesan imobilisasi pada integriti DNA
Elektroforesis gel agarose menunjukkan bahawa kualiti DNA yang diasingkan daripada bahagian parafin bedah siasat berbeza dengan ketara. DNA dengan panjang serpihan purata berbeza hadir dalam ekstrak bergantung kepada kaedah penetapan. DNA telah dipelihara hanya apabila ditetapkan dalam sampel beku asli dan dalam formalin neutral terbuffer. Penggunaan bahan fiksatif Bouin yang sangat berasid atau tidak buffer, formalin yang mengandungi asid formik mengakibatkan kehilangan DNA yang ketara. Pecahan yang tinggal sangat berpecah.
Di sebelah kiri, panjang serpihan dinyatakan dalam pasangan kilobase (kbp)

Rajah 2 | Kehilangan integriti sasaran asid nukleik
(a) Jurang 3′-5′ pada kedua-dua helai akan mengakibatkan pecahnya DNA sasaran. sintesis DNA masih akan berlaku pada serpihan kecil. Walau bagaimanapun, jika tapak penyepuhlindapan primer tiada pada serpihan DNA, hanya penguatan linear berlaku. Dalam kes yang paling baik, serpihan mungkin tepu satu sama lain, tetapi hasil akan menjadi kecil dan di bawah tahap pengesanan.
(b) Kehilangan bes, terutamanya disebabkan oleh depurination dan pembentukan dimer timidin, membawa kepada penurunan bilangan ikatan-H dan penurunan dalam Tm. Semasa fasa pemanasan yang memanjang, primer akan mencairkan DNA matriks dan tidak akan menyelinap walaupun dalam keadaan yang kurang ketat.
(c) Bes timin bersebelahan membentuk dimer TT.
Satu lagi masalah biasa yang sering berlaku dalam diagnostik molekul ialah pelepasan asid nukleik sasaran yang kurang optimum berbanding dengan pengekstrakan fenol-kloroform. Dalam kes yang melampau, ini boleh dikaitkan dengan negatif palsu. Banyak masa boleh dijimatkan dengan lisis mendidih atau penghadaman enzimatik serpihan sel, tetapi kaedah ini selalunya menghasilkan kepekaan PCR yang rendah disebabkan oleh pelepasan asid nukleik yang tidak mencukupi.

Perencatan aktiviti polimerase semasa amplifikasi

Secara amnya, perencatan digunakan sebagai konsep bekas untuk menerangkan semua faktor yang membawa kepada keputusan PCR yang tidak optimum. Dalam pengertian biokimia yang ketat, perencatan adalah terhad kepada aktiviti enzim, iaitu, ia mengurangkan atau menghalang penukaran produk substrat melalui interaksi dengan tapak aktif polimerase DNA atau kofaktornya (cth, Mg2+ untuk polimerase DNA Taq).
Komponen dalam sampel atau pelbagai penimbal dan ekstrak yang mengandungi reagen boleh secara langsung menghalang enzim atau memerangkap kofaktornya (cth EDTA), dengan itu menyahaktifkan polimerase dan seterusnya membawa kepada keputusan PCR negatif yang menurun atau palsu.
Walau bagaimanapun, banyak interaksi antara komponen tindak balas dan asid nukleik yang mengandungi sasaran juga ditetapkan sebagai 'perencat PCR'. Sebaik sahaja integriti sel terganggu oleh pengasingan dan asid nukleik dibebaskan, interaksi antara sampel dan larutan di sekelilingnya dan fasa pepejal boleh berlaku. Sebagai contoh, 'pemulung' boleh mengikat DNA untai tunggal atau berganda melalui interaksi bukan kovalen dan mengganggu pengasingan dan penulenan dengan mengurangkan bilangan sasaran yang akhirnya sampai ke saluran reaksi PCR.
Secara amnya, perencat PCR terdapat dalam kebanyakan cecair badan dan reagen yang digunakan untuk ujian diagnostik klinikal (urea dalam air kencing, hemoglobin dan heparin dalam darah), makanan tambahan (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) dan komponen dalam persekitaran (fenol). , logam berat)

Perencat PCR yang lebih lazim boleh didapati dalam bakteria dan sel eukariotik, DNA bukan sasaran, makromolekul DNA yang mengikat matriks tisu dan peralatan makmal seperti sarung tangan dan plastik. Pembersihan asid nukleik semasa atau selepas pengekstrakan adalah kaedah pilihan untuk mengeluarkan perencat PCR.
Hari ini, pelbagai peralatan pengekstrakan automatik boleh menggantikan banyak protokol manual, tetapi 100% pemulihan dan/atau pemurnian sasaran tidak pernah dicapai. Perencat berpotensi mungkin masih terdapat dalam asid nukleik yang telah dimurnikan atau mungkin telah berkuat kuasa. Strategi yang berbeza wujud untuk mengurangkan kesan perencat. Pemilihan polimerase yang sesuai boleh memberi kesan yang ketara ke atas aktiviti perencat. Kaedah lain yang terbukti untuk mengurangkan perencatan PCR ialah meningkatkan kepekatan polimerase atau menggunakan bahan tambahan seperti BSA.
Perencatan tindak balas PCR boleh ditunjukkan dengan penggunaan kawalan kualiti proses dalaman (IPC).
Penjagaan mesti diambil untuk mengeluarkan semua reagen dan larutan lain dalam kit pengekstrakan, seperti etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol dan fenol, daripada pengasingan asid nukleik dengan langkah pencucian yang menyeluruh. Bergantung pada kepekatannya, mereka mungkin mengaktifkan atau menghalang PCR.